După urmașii imediați ai Sfântului Ștefan, care au purtat în mod firesc grijă de mănăstire, legătura Putnei cu voievozii Moldovei nu a încetat. Ba chiar se poate constata că cei mai străluciți domni au venit și ei la Putna, simțindu-se datori să continue ceea ce începuse aici voievodul model pe care cu toții îl aveau în fața ochilor, Sfântul Ștefan.

Alexandru Lăpușneanu (1552–1561, 1564–1568), căsătorit cu domnița Ruxandra, fiica lui Petru Rareș și a prințesei Elena Brancovici, deși a ctitorit la Slatina propria necropolă, s-a alăturat și el voievozilor ctitori la Putna. În 1559, a construit aici o clădire, de la care s-a păstrat doar pisania.

Soția sa a înnoit ferecătura de argint a Tetraevanghelului lui Paladie. Împreună, în iunie 1567, ei au dăruit un colivar de argint și au refăcut o cristelniță de argint aurit, care fusese dăruită Putnei de Sfântul Ștefan cel Mare.

În această perioadă sunt ridicați la rangul de ierarhi unii dintre monahii putneni, prețuiți pentru virtuțile lor. Egumenul Anastasie a fost ales în 1558 Episcop de Roman, apoi mitropolit, după care s-a retras la Putna. Cronicarul Azarie îl descrie astfel: „bărbat blând, liniștit, plin de înțelepciune, de asemenea împodobit cu deșteptăciune smerită, având pe față și în inimă florile darului binefacerii”.

Un alt monah putnean devenit Episcop de Roman a fost Eustatie (1576–1580). După retragerea de pe scaunul arhieresc, a luat schima mare și numele Ieremia. El a cerut „ritorului și scholasticului Lucaci” să scrie pentru mănăstire o pravilă, un cod de legi bisericești și civile, în 1581. Cunoscută ca „Pravila ritorului Lucaci”, această scriere are o importanță deosebită pentru dreptul românesc. O parte dintre prevederile cu caracter juridic au fost redate și în limba română. În această perioadă, s-a realizat traducerea unei cărți celebre în cultura europeană, „Fiore di Virtù” – „Floarea darurilor”, în care virtuțile („darurile”) sunt prezentate în opoziție cu patimile. Cu aceste două traduceri, Mănăstirea Putna își rezervă un loc deosebit în ceea ce P.P. Panaitescu a numit „biruința scrisului în limba română”.

Din această vreme se păstrează și cea mai veche mărturie despre existența unui atelier de sculptură în lemn.

Veacul al XVII-lea reprezintă pagina cea mai puțin cunoscută din istoria Mănăstirii Putna, poate și din cauza multelor tulburări care au afectat Moldova și, implicit, viața monahală.

În iunie 1622 este menționat un atac al tâlharilor. În 1629, mănăstirea a fost amenințată de tătari. O nouă lovitură va fi în februarie 1676, când „au venit leșii și cazacii și au jefuit mănăstirea și au ars-o toată, până în temelii”.

Cu toate aceste încercări teribile, în care au fost uciși monahi iar odoarele au fost prădate, mănăstirea a fost în continuare un centru viu și puternic al Ortodoxiei. Viața duhovnicească a mănăstirii l-a atras pe un tânăr din Galiția, care a venit în Moldova și a fost călugărit la Putna. Sfântul Teodosie de la Maniava (†1630) a devenit apoi egumen al Schitului Mare – Maniava din Galiția, pe atunci în Polonia, azi în Ucraina.

La mijlocul veacului al XVII-lea, în Putna a viețuit ca ieromonah Sfântul Ilie Iorest, ales în 1640 Mitropolit al Transilvaniei, la recomandarea lui Vasile Lupu, domnul Moldovei. Prigonit de Principele calvin al Transilvaniei, a fost destituit și închis, în 1643, revenind apoi la Putna, unde a murit în 1678.

Spre sfârșitul domniei sale, Voievodul Vasile Lupu a dorit să refacă biserica, șubrezită de vreme mai ales în zona temeliilor. Pentru aceasta, a desfăcut zidurile bisericii și a început să le reconstruiască pe o temelie mai largă decât cea a vechilor fundații. Dar Vasile Lupu și-a pierdut domnia în primăvara anului 1653, iar în vară a avut loc în Moldova o cumplită campanie a cazacilor conduși de Timuș Hmelnițchi, care au ars mănăstirea și au luat plumbul folosit la acoperiș.

Sub următorii domni, Gheorghe vodă Ștefan (1653–1658), Ștefăniță Lupu (1659–1661), fiul lui Vasile Lupu, și Istratie vodă Dabija (1661–1665) s-a continuat refacerea bisericii. Încheierea lucrărilor este menționată pe pisania așezată deasupra intrării în pronaos: „† Această biserică a înnoit-o Io Gheorghie Ștefan voievod și s-a terminat în zilele lui Io Istratie Dabija voievod, în anul 7170”.